La tesis doctoral de Xavier Mulet investiga los mecanismos implicados en la resistencia antibiótica de los biofilmes de Pseudomonas aeruginosa, así como la implicación de la hiperexpresión de bombas de expulsión activa en la aparición de interacciones antagónicas entre diferentes mecanismos de resistencia durante el tratamiento de la infección respiratoria crónica
En los últimos años, la azitromicina ha mostrado resultados prometedores en el tratamiento de la infección respiratoria crónica por Pseudomonas aeruginosa. A pesar de que no presenta actividad bactericida ante este microorganismo en cultivo planctónico, se sabe que este macrólido inhibe el crecimiento en forma de biofilm gracias a su capacidad para bloquear o interferir el sistema de percepción de quórum bacteriano. En el transcurso de las infecciones crónicas a menudo se seleccionan mutantes que presentan un grado de adaptación al nicho ecológico y a los antibióticos, tal como sucede con el mutante nfxB, gen regulador negativo de la bomba de expulsión activa MexCD-OprJ.
Dicho fenotipo frecuentemente es aislado en muestras respiratorias de pacientes con fibrosis quística, MPOC y bronquiéctasis, y se caracteriza porque presenta resistencia a los antibióticos que pueden actuar como substrato (como ciprofloxacina, cefepima o azitromicina) y porque presenta una marcada hipersensibilidad a los antibióticos betalactámicos no substratos de la bomba y aminoglucósidos.
Por tanto, uno de los principales objetivos de la tesis doctoral de Francesc Xavier Mulet Aguiló ha sido averiguar si durante la exposición prolongada a azitromicina se seleccionan mutantes nfxB tanto en cultivo planctónico como en forma de biofilm. Ademas, se ha evaluado el impacto de la hiperproducción de alginado y el efecto de la hipermutación sobre el efecto bactericida, sobre la dinámica de desarrollo de resistencias a azitromicina y sobre la posible aparición de resistencias cruzadas. También ha sido objeto de estudio la caracterización del mutante nfxB, así como la relación entre la hiperexpresión de MexCD-OprJ (a través de la mutación en su gen regulador nfxB), la actividad de la cefalosporinasa cromosómica AmpC, y las bombas de expulsión intrínsecas MexAB-OprM y MexXY-OprM.
Para llevar a cabo estos objetivos se construyeron mutantes deficientes en el gene mucA (la variante mucoide PAOMA), mutS (cepa hipermutadora PAOMS) y la combinación de ambos (PAOMSA) mediante el sistema Cre-Lox. Seguidamente se procedió a evaluar el comportamiento de los mutantes en crecimiento en forma de biofilm cuando son tratados con diferentes concentraciones de azitromicina, así como la dinámica de desarrollo de resistencias durante algunos días. Se caracterizaron los mutantes resistentes a azitromicina, se determinaron el perfil de sensibilidad, se cuantifico la expresión relativa de mexD como representante de la bomba de expulsión activa MexCD-OprJ mediante PCR a tiempo real, y finalmente se secuenció el gen regulador nfxB revelando diversas mutaciones inactivantes. En resumen, los resultados obtenidos por el investigador de la UIB han permitido demostrar que durante el tratamiento de biofilmes con azitromicina hay una selección de mutantes nfxB en las cepas salvajes, las hiperproductoras de alginado y particularmente en las cepas hipermutadoras.
Seguidamente se construyó el mutante nulo nfxB y se procedió a evaluar sus propiedades biológicas, la sensibilidad al complemento del suero humano y la tasa y frecuencia de mutación en rifampicina. Finalmente se analizó su transcriptoma, se mostró que aparentemente no se sobreexpresan genes implicados en la resistencia antibiótica, exceptuando aquellos que pertenecen al operón mexCD-oprJ. Aunque en el perfil de proteínas fijadoras de penicilina no se encontraron diferencias entre el mutante nfxB y la cepa de referencia, el análisis de proteínas de membrana externa reveló una disminución de la expresión de OprM, responsable de la hipersensibilidad a aminoglucósidos y betalactámicos con la excepción del imipenem. De forma análoga, la disminución de la expresión de OprM no justificó la reversión del fenotipo de resistencia a betalactámicos en el mutante nfxB-dacB. No obstante, la determinación fraccionada (extracto crudo, periplasma y sobrenedante) de la actividad betalactamasa específica del mutante nfxB y del mutante doble nfxB-dacB mostró un drástico descenso de la actividad periplasmática como consecuencia de la inactivación de nfxB, a costa de un aumento de la actividad medida en el sobrenedante. A continuación se evaluó si esta diferencia resultaba beneficiosa en el seno de un biofilm tratado con antibióticos betalactámicos, y se demostró que efectivamente en este escenario el mutante nfxB tiene una supervivencia superior a la de sus cepas parentales tanto en condiciones de inducción como en condiciones de hiperproducción constitutiva por desrepresión de la expresión de ampC, a través de la mutación a dacB.
Así, los datos obtenidos por Francesc Xavier Mulet Aguiló revelan que la hipersensibilidad a betalactámicos es debida a la incapacidad para acumular AmpC en el espacio periplasmático, y que se produce una permeabilización hacia el medio extracelular. No obstante un análisis de este fenómeno nos ha permitido describir como esta permeabilización resulta beneficiosa para la comunidad formadora del biofilm, dado que AmpC quedaría recluido dentro de su matriz. La posterior inactivación de nfxB en cepas clínicas demostró que este hallazgo no es específico de la PAO1.
Finalmente, los datos preliminares sugirieron que la permeabilización que experimenta AmpC en el mutante nfxB ocurre también con otras betalactamasas, particularmente de las clases B y D.
Ficha de la tesis doctoral
- Título: Caracterización del mutante nfxB de Pseudomas aeruginosa: papel en la resistència antibiòtica de los biofilms e interacción con los mecanismos de resistencia intrínsecos
- Autor: Francesc Xavier Mulet Aguiló
- Programa de doctorado: Microbiología Ambiental y Biotecnología
- Departamento: Biología
- Director: Antoni Oliver Palomo
Fecha de publicación: 13/02/2015